PCR 技術(shù)自發(fā)明以來(lái)已經(jīng)三十多年，一直廣泛應用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，普通定性PCR在基礎研究中仍舊是不可或缺的環(huán)節。今天小寶來(lái)聊一聊定性PCR儀更為實(shí)驗人員關(guān)注的溫控性能和常見(jiàn)問(wèn)題。
對普通PCR儀來(lái)說(shuō)，溫度控制指標主要是指溫度的準確性、均一性、以及升降溫速度。
溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實(shí)驗的成敗。如果排除樣品加入過(guò)程中的失誤操作問(wèn)題，對于PCR反應而言更重要的莫過(guò)于溫度控制的準確性。
溫度的均一性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進(jìn)行反應結果的一致性。
寶予德Life Eco PCR基因擴增儀，采用專(zhuān)利的TAS技術(shù)，通過(guò)特殊的高分子材料處理有效的避免了熱傳導的邊緣效應。
升降溫的速度是指在PCR不同反應階段溫度升降的速度。顯然，更快的升降溫速度，可以縮短反應所需的時(shí)間，而且有效降低由于升降溫過(guò)程產(chǎn)生的非特異性結合、縮短了反應的時(shí)間，能提高PCR反應的特異性。
但是，值得注意得是儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會(huì )影響樣品的實(shí)際升降溫速度。
Life Eco具有兩種控溫模式：Block控溫模式、Tube控溫模式。在Block模式下，儀器會(huì )根據探測器直接探測的溫控模塊的溫度進(jìn)行控制，這種模式適用于長(cháng)時(shí)間的靜態(tài)孵育，如連接、酶切、去磷酸化等。Tube模式實(shí)際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據探測器所探測到的溫控模塊的溫度由微計算機計算出管內/PCR板孔內樣品液的溫度來(lái)進(jìn)行控制。一般說(shuō)來(lái)，Tube模式更為準確，因為管內樣品的溫度無(wú)法與溫控模塊同時(shí)達到預設溫度。因此小寶建議在應用LifeEco PCR基因擴增儀時(shí)采用Tube控溫模式。
1. 陰性對照和陽(yáng)性對照都出現陽(yáng)性擴增帶
原因
①陰性樣品和PCR 反應試驗污染。
②電泳上樣時(shí)避免PCR 產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結果判定。
解決方法
①更換全部試劑，必要時(shí)更換所有移液器。
②應小心操作，或瓊脂糖凝膠加厚，增加每孔的容量，可避免加樣液的溢出。
2. 陽(yáng)性對照呈陰性
原因
①陽(yáng)性樣品或加入陽(yáng)性模板失效。無(wú)論是組織還是血清，凍融1 次后病原數量明顯減少。
②加入試劑量不準確或遺忘了某一成分。
解決方法
①將陽(yáng)性對照樣品分成小包裝。每個(gè)包裝夠用1 次更好。
②仔細核對試驗記錄，校對移液器。
3. 出現非特異擴增帶
原因
①樣品模板量過(guò)多。
②引物或TaqDNA 聚合酶多。
③鎂離子濃度過(guò)高或退火溫度過(guò)低。
解決方法：
依據具體實(shí)驗的情況，分析上述可能出現的原因，采取相應的措施。
4. 陽(yáng)性對照擴增帶弱
原因
①電泳時(shí)瓊脂糖中EB含量少或長(cháng)時(shí)間后再用已失效。
②擴增效率不高。
解決方法
①是將瓊脂糖凝膠放入含有EB 電泳液中再染30 min 后再觀(guān)察。
②檢測儀器是否正常工作。
③增加純化DNA 或cDNA 樣品的稀釋倍數。
彩蛋來(lái)了
擴增效率不高的原因
a.反應體系問(wèn)題，操作中加入緩沖液、TaqDNA 聚合酶、引物等不準確，造成不能達到更佳反應體系。
b.儀器不能正常工作。
c.樣品處理過(guò)程中殘留有較多PCR 反應抑制物造成的。多數情況是由于操作者怕PCR 不出陽(yáng)性，有意無(wú)意提高PCR 檢測樣品量造成的。
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